熒光PCR法檢測試劑盒是一種基于聚合酶鏈式反應（PCR）技術的分子生物學檢測工具，其核心在于利用序列特異性的熒光標記探針來實現對靶標核酸的高特異性擴增與實時檢測。該試劑盒通常包含熱啟動DNA聚合酶、引物、熒光探針、dNTPs及優化緩沖液等組分。
使用熒光PCR檢測試劑盒，核心在于嚴格分區操作、精準配制反應體系并規范上機擴增。以下是關鍵步驟和注意事項：
1.實驗前準備
分區操作：實驗室應分為試劑準備區、樣本制備區、擴增區和產物分析區。使用實時熒光PCR儀時，擴增區與產物分析區可合并。
試劑解凍：從-20℃冰箱取出試劑盒，室溫解凍約15分鐘。振蕩混勻5秒，離心5秒使管壁液體集中。
2.樣本處理與核酸提取
樣本處理：將病毒采樣管在旋渦混合儀上震蕩5秒混勻。推薦使用磁珠法提取核酸，加入200μL樣本至提取板，20-30分鐘后獲得50-100μL核酸。
核酸保存：提取后若不立即檢測，可暫存于-20℃或-70℃，避免反復凍融。
3.反應體系配制
分裝體系：準備標記好的A、B、C管，按比例配制反應液。振蕩混勻10秒，瞬時離心5秒。
加樣：使用八聯管分裝，每孔20μL。取5μL核酸分別加入A、B、C體系，并加入陰陽性對照。蓋緊管蓋后瞬時離心，檢查液面高度是否均一。
4.上機擴增
儀器設置：打開儀器軟件。將配制好的試劑和對照品傳遞至擴增區。
擴增程序：通常包括逆轉錄（如45℃ 10分鐘）、預變性（如95℃ 5分鐘）和循環擴增（如95℃ 15秒，60℃ 60秒，40個循環）。
5.結果分析
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更新時間：2025-12-11
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