中文名稱：熒光定量RT-PCR試劑盒（兩步法）

英文名稱：Two-Step qRT-PCR Kit

規格及成分

熒光定量RT-PCR試劑盒（兩步法）低溫運輸,-20℃保存, 有效期一年。

自備試劑

樣品 RNA、PCR 引物、ROX 染料

熒光定量 RT-PCR 試劑盒（兩步法） 特點：

1.    即開即用，足夠 50 次 RT 反應（10uL 體系）和 50 次 qPCR 反應（20 uL 體系）。

2.    RT 和 PCR 分開進行，方便優化 RT 和 qPCR 條件，也方便一個 RT 反應用于多個不同引物的 qPCR 擴增。

3.    RT mix 中含除酶、模板和引物以外的 RT 成分，簡化了反應設置步驟。

4.    qPCR mix 是 2×預配液，也簡化了反應設置步驟。

5.    qPCR mix 含 qPCR 染料，無需另外加入相關熒光 PCR 染料。

6.    擴增效率高, 最長可擴增 5 Kbp 以上的 RNA。

7.    提供定量 PCR 專用模板稀釋液，保證在制作標準曲線時低濃度樣品的準確性。

使用方法

一、樣品 RNA 的制備（本試劑盒不提供相關試劑）

1、可用自本公司各種 RNA 提取方法提取樣品的 RNA，也可以選用其他供應商的產品，但得到的 RNA 一定要溶解在RNase-free 的超純水中。

2、如果需要用 RNA 制備標準曲線，則需在此步用定量 PCR 專用模板稀釋液將 RNA 樣品稀釋不同梯度，并分別作為下步 RT 反應的模板。

3、由于污染的 gDNA 會嚴重影響 RNA 的定量，因必須che底去除 RNA 樣品中的gDNA 污染。用戶可以另購 RNase-free DNase 來消化 RNA 樣品，也可以合成只識別外顯子的引物。

二：RT（逆轉錄）反應合成 cDNA

4、按下表配制 RT 反應體系（10 uL 體系），在每個管中加入下列成分:

5、42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應。

6、85℃保溫 5 秒以終止反應，然后放置在冰上待用。

7、合成的 cDNA 可以直接作為下步 qPCR 模板使用，不需要純化。剩余樣品可以放置在

-20℃長期保存。如果需要用 cDNA 制備標準曲線，則需在此步用定量 PCR 專用模板稀釋液將 cDNA 樣品稀釋不同梯度，并分別作為下步qPCR 反應的模板。

三、qPCR（20 uL 體系）

8、在每個 PCR 管中加入下列成分：

注意：如果使用 ABI 公司的 7500，7700 和 7900 三種型號的熒光 PCR 儀器，則需用自備的 ROX 進行 Ct 值校正。對 ABI 7700 和 7900，ROX 的最佳濃度為 1×（即在每 20 uL 反應體系中加 2 uL 10×ROX）。對 ABI 7500， ROX 的最佳濃度為 0.05-0.1×（每 20 uL 反應體系加 0.1-0.2 uL 10×ROX；也可將 10×ROX 稀釋到

1×，然后每個反應體系加入 1-2 uL 1×ROX）。ROX 會在溶解曲線中產生噪音，因此，如果出現了雜峰，將軟件中“Passive Reference Dye"中的“ROX"選項取消打勾，然后重新分析數據。

對于iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000, RotorGene3000， RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型號的熒光PCR 儀器，ROX 不是必須的但加入的話也不會影響整個 PCR 分析。

9、PCR 反應參數(需要用戶根據模板和引物決定，下面參數的只做參考)：

10、 實驗結果分析：反應結束后確認擴增曲線和溶解曲線，制作標準曲線。具體方法

隨儀器不同而不同，請參考 qPCR 儀器手冊。

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