兩管式RT-PCR試劑盒（MMLV-Taq）說明書

中文名稱：兩管式RT-PCR試劑盒（MMLV-Taq）

英文名稱：Two-Tube  RT-PCR Kit（AMV-Taq）

本試劑盒是整合 cDNA 第一鏈合成試劑和即用型 PCR 試劑而得的 RT-PCR 試劑盒。cDNA 第一鏈合成反應和PCR 反應分別在兩個離心管中進行。

規格及成分：

RT試劑盒成分表：

即用型 PCR 試劑盒成分表：

兩管式RT-PCR試劑盒（MMLV-Taq）具有以下特點：

1.即開即用，足夠 50 次 RT 反應（20 uL 體系）和 600 次PCR 反應（30 uL 體系）。

2.cDNA 第一鏈合成試劑盒可靈活選用隨機引物、Oligo dT 引物或基因專一引物，適合各種情況。

3.PCR 試劑盒具有即用、簡單等優點，PCR mix 中含上樣染料，所以 PCR 產物可以直接上樣電泳。

4. 兩管式操作，RT 和PCR 在不同試管中進行，便于單獨優化 RT 反應或PCR 反應條件。

5.擴增效率高, 最長可擴增 5 Kbp 以上的 RNA。

運輸及保存

低溫運輸,-20℃保存, 有效期一年。

自備試劑

樣品 RNA、模板專一正向和反向引物。

使用方法：

一、樣品 RNA 的制備（本試劑盒不提供相關試劑）

可用自本公司各種 RNA 提取方法提取樣品的 RNA，也可以選用其他供應商的產品，但得到的 RNA 一定要溶解在RNase-free 的超純水中。

二：RT（逆轉錄）反應合成 cDNA

1.按下表配制 RT 反應體系（20 uL 體系）:

注意：RNA 樣品不能含有基因組 DNA 污染。隨機引物與 RNA 模板的比例將決定cDNA 合成的平均長度（成反比）。一般情況下隨機引物效率好于 OligodT 引物，但如果只想轉錄總 RNA 中的 mRNA（只占 5%左右），則可優先選用 OligodT 引物，這樣就可以排除非mRNA 的干擾。

2.70℃保溫 5 分鐘變性模板后立即冰浴。

3.按順序加入 6 uL RT Buffer（含 dNTP）和 2 uLMMLV 逆轉錄酶（含 RI），反應終體積為 20 uL。

4.42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應。

5.70℃保溫 10 分鐘以終止反應，然后放置在冰上待用。

6.合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，不需要純化。剩余樣品可以放置在-20℃長期保存。

三、PCR（30 uL 體系）

1、將全部專用染料加入到PCR MagicMix 3.0 中，輕柔顛倒混勻即可使用。未用完的部分需要在-20℃。也可以不加專用染料，但在 PCR 結束后，電泳上樣前，則需要加入電泳上樣液，否則電泳時沒法判斷電泳速度。

2、在 PCR 管中加入下列成分：

注意：cDNA 也可以稀釋后用作 PCR 模板。是否稀釋或稀釋多少倍wan全取決于靶基因的豐度。

PCR 反應參數(需要根據模板和引物決定，下面的只做參考)：

四、電泳檢測

1、取 5-0 uL PCR 產物直接在PAGE 或瓊脂糖凝膠上電泳，跟分子量標準比較估計出擴增產物的大小。注：本試劑盒中的PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上樣，不需要

額外再加電泳上樣液。

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