副流感病毒通用探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

商品名稱：副流感病毒通用探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

副流感病毒是常常引起兒童下呼吸道感染的一種病毒，其致病性僅次于呼吸道合胞病毒 (RSV)。與RSV一樣，人類副流感病毒可以造成反復(fù)發(fā)作的上呼吸道感染（如感冒和喉嚨痛）。它也能造成嚴(yán)重的反復(fù)感染的下呼吸道疾病（如肺  炎，支氣管炎和細(xì)支氣管炎），特別是在老年人中和有免疫缺陷人群中。因此快速靈敏診斷具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測副流感病毒的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.  特異性高，引物是根據(jù)副流感病毒高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病毒的 RNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

【試劑組成】

【儲(chǔ)存條件及有效期】

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

【自備試劑】樣品 DNA。

【使用方法】

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。

     1.    由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，  本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對(duì)照1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2.       用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震

蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.       換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.       換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

      6.       重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7.       如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性

對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 陽性對(duì)照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。

8.       用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 20 次免 RNA 提取的核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為RT-PCR 模板， 省略了 RNA 提取步驟。其使用手冊可向本公司客服索取。

三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.       如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.       在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)

置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好  后最后加）：

五、數(shù)據(jù)處理

12.     如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13.     如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。