綠膿假單胞菌探針法熒光定量PCR試劑盒

產品名稱：綠膿假單胞菌探針法熒光定量PCR試劑盒

英文名稱：Pseudomonas aeruginosa Probe qPCR Kit

綠膿假單胞菌又稱銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），1882 年首先由 Gersard 從傷口膿液中分離到，是一種革蘭氏陰性菌、好氧、呈長棒形的細菌，只有單向的運動性。它是一種機會性感染細菌，且對植物亦是機會 性感染的，感染后因膿汁和滲出液等病料呈綠色，故名。廣泛分布于自然界及 正常人皮膚、腸道和呼吸道，是臨床上較常見的條件致病菌之一，因此快速檢測綠膿假單胞菌具有重要意義。本產品就是以探針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發的專門檢測綠膿假單胞菌的試劑盒，它具有下列特點：

1.    即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2.    引物和探針經過優化，靈敏性高。

3.    提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4.    特異性高，引物是根據綠膿假單胞菌高度保守區設計，不會跟其他病原菌

DNA 發生交叉反應。

5.    本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

【試劑組成】

【運輸及保存】

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

【自備試劑】

樣品 DNA。

【使用方法】

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原， 本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，

2.    下同）。

在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震

蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.    換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.    換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.   重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.    如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性

對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。

8.    用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA/提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9.    如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.    在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好

后最后加）：

四、數據處理

12.  如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13.  如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結果 Ct值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。